Реагенты для ПЦР анализа

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) представляет собой биотехнологический метод, который используется для амплификации (увеличения количества) фрагментов ДНК. ПЦР это искусственная репликация ДНК.

Для проведения ПЦР необходимо наличие в реакционной смеси (РС) ряда основных компонентов.

Праймеры – искусственно синтезированные олигонуклеотиды, имеющие, как правило, размер от 15 до 30 нуклеотидов, идентичные (комплементарные) противоположным концам противоположных цепей искомого участка ДНК-мишени. Служат затравкой для синтеза комплементарной цепи с помощью ДНК-полимеразы и играют ключевую роль в образовании и накоплении продуктов реакции амплификации.

Правильно подобранные праймеры обеспечивают специфичность и чувствительность тест-системы и должны отвечать ряду критериев:

• быть специфичными. Особое внимание уделяют 3′-концам праймеров, так как именно с них Taq-полимераза начинает достраивать комплементарную цепь ДНК. При недостаточной специфичности праймеров в процессе ПЦР будут образовываться продукты, которые, с одной стороны, могут быть идентифицированы как ложноположительный результат, а с другой стороны, на процессы их накопления будут расходоваться компоненты реакционной смеси, что приведет к значительной потере чувствительности реакции как таковой;
• не должны образовывать димеры и петли – устойчивые двойные цепи – при отжиге праймеров самих на себя или друг с другом;
• область отжига праймеров должна находиться вне зон мутаций, делеций или инсерций в пределах видовой или иной специфичности, взятой в качестве критерия при выборе праймеров. При попадании в такую зону не происходит отжига праймеров и, как следствие, возникает ложноотрицательный результат.

Taq-полимераза – термостабильный фермент, который обеспечивает достраивание 3′-конца второй цепи ДНК согласно принципу комплементарности.

Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ) – дезоксиаденозинтрифосфат (дАТФ), дезоксигуанозинтрифосфат (дГТФ), дезоксицитозинтрифосфат (дЦТФ) и дезокситимидинтрифосфат (дТТФ) – строительный материал, используемый Taq полимеразой для синтеза второй цепи ДНК.

Буфер  – смесь катионов и анионов в определенной концентрации, обеспечивающей оптимальные условия для реакции, а также стабильное значение рН.

Анализируемый образец  – подготовленный к внесению в реакционную смесь препарат, который может содержать искомую НК, например ДНК микроорганизмов, служащую мишенью для последующего